雙光子顯微鏡的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子;其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,為了不損傷細(xì)胞,雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖寬度只有 100 飛秒,而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí),物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是最高的,雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔,提高了熒光檢測(cè)效率。
從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):
光損傷小:由于雙光子顯微鏡使用的是可見(jiàn)光或近紅外光作為激發(fā)光源,這一波段的光對(duì)活體細(xì)胞和組織的光損傷小,適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究;
穿透能力強(qiáng):相對(duì)于紫外光,可見(jiàn)光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,因而受生物組織散射的影響更小,解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問(wèn)題;
高分辨率:由于雙光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,雙光子吸收僅局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi);
漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象;
熒光收集率高:與共聚焦成像相比,雙光子成像不需要光學(xué)濾波器(共焦針孔),這樣就提高了對(duì)熒光的收集率,而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高;
圖像對(duì)比度高:由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng),因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,大大降低了散射的干擾;
光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,所以可以對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究;
避免組織自發(fā)熒光的干擾,獲得較強(qiáng)的樣品熒光:生物組織中的自發(fā)熒光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)一般在350~560nm范圍內(nèi),采用近紅外或紅外波段的激光作為光源,能大大降低生物組織對(duì)激發(fā)光吸收。